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徕卡、珊顿、美康。切片这个系列，不管是石蜡切片、冰冻切片、振荡切片或者是超薄切片，徕卡肯定都是最优秀，性价比最高的。RM2235是徕卡最经典的石蜡切片机，切片机最重要的技术参数就是切片厚度均衡、平滑、连续，而徕卡这点都能做到，基本上一台RM2235很多年，切片机所谓的新型号都是往电动这方面去发展，徕卡的RM2245半自动切片机，RM2255全自动切片机等等都是这个系列；还有即使硬组织切片机（牙齿和骨头方面），超薄切片机(肾穿方面)。珊顿，产品和服务都不错，现在Shandon和Microm是合一家了，都叫做Thermo.中文名是赛默飞世尔，华南区的总代理还是广州华俊公司
质粒与siRNA转染试剂的选择
“ SnapGene是构建质粒的利器。 ”
上次介绍了双酶切克隆和TA克隆，这次介绍一种和TA克隆比较相似的TOPO克隆，唯一的区别就是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T载体上，而TOPO克隆是基于拓扑异构酶(Toposiomerase)的克隆，是一种不利用限制酶和连接酶的DNA克隆方法，该技术依赖于A和T碱基的互补配对，因此也可以称为TOPO-TA，用于黏性末端；当然也可用于平末端的连接。
这一部分以PDCD-1(程序性死亡受体1)为目的片段，使用TOPO克隆方式进行构建目的载体。
1. TOPO克隆作用机制
拓扑异构酶(Toposiomerase)是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑结构，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模版的调节。
?PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。TOPO克隆使用了牛痘病毒中分离出的拓扑异构酶I，识别DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切双链DNA，暴露出T位点同时DNA断裂释放的能量储存在其 3'胸腺嘧啶脱氧核苷的磷酸基团和拓扑异构酶I上的酪氨酸残基之间的共价键中。它在识别位点切割DNA一条链，然后使其解链，之后TA配之后酶会重新连接被切割的位点，并将自身从DNA上释放出来。下图为黏性末端和平末端基础机制。
Taq 扩增的DNA的TOPO TA Cloning
利用Zero Blunt TOPO克隆方法克隆平末端DNA。
利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。
来自于赛默飞官网
2. TOPO工作流程
基本上和TA克隆是相似的，感兴趣的可以看看前面的。这里简略介绍一下，就是目的片段扩增好之后与TOPO质粒载体共孵育5min即可进行下一步的感受态细胞转化。
3. 目的片段的获取
在NCBI上按照上次的方法找到PDCD-1的CDS片段，然后导入到snapgene中，做好自己想要的特征标记。
4. TOPO克隆
1. 将目的片段选择好之后，选择作为PCR模板，用来设计后续的引物；也可以按自己需求直接作为模板。
2. 选择合适满足自己需求TOPO-TA克隆的质粒载体。
3. 选择引物，snapgene会按照Tm设计好扩增引物
4. 点击克隆，名字取好，就可将目的质粒保存好，进行后续的研究。
同理，TOPO平端克隆也是同样的操作。
同理，TOPO定向克隆也是同样的操作。
5. 模拟电泳
模拟电泳是snapgene中非常有趣和实用的一个功能，在这里补充介绍一下。
上图是电泳界面，简单一一介绍一下。
1.?电泳图谱
和实际电泳图跑出来非常相似，可以用来提前预测结果，然后进行结果对照，查看问题点在哪里，下方是泳道信息调整和相对应的工具栏。
2. 泳道调整和酶切位点的选择
进行每一个泳道的调整和选择相应的酶切位点进行电泳。
3.?质粒图谱
质粒图谱和相对应的工具栏，和之前的界面是一样的，都可以进行操作。
泳道1 是线性PCDC1的电泳图
泳道2 是质粒的超螺旋电泳图，能够明显看到质粒是6708bp分子量，但是超螺旋的质粒明显在6kb marker下面，这主要是因为DNA在超螺旋后，改变了自身的拓扑结构，消除了部分溶液中与其作用的氢键，使DNA磷酸骨架中更多的负电荷直接暴露在了电场之中，在电泳的作用下，其可更快速的移动至正极，使得电泳结果看起来分子量要偏小一些。
泳道3 是使用一个酶切线性化后的电泳图，分子量就符合预期。
泳道4 是使用两个酶酶切后的电泳图
泳道5 是使用引物扩增之后得到产物的电泳图，可用来鉴定。
最后一个TOPO克隆设计就完成了，另外还介绍了模拟电泳的使用。这只是前面最基础的设计部分，依靠软件即可完成，后续的鉴定，转化，验证，表达，纯化等等都需要大量的学习才能顺利完成，希望这部分内容能对大家有所帮助。
质粒转染试剂是质粒转染能否成功的关键。目前，最为知名和权威的质粒转染试剂无疑是国际巨头赛默飞的Lipofectamine3000，但此君好用，身价不菲。一支1.5ml的Lipofectamine3000，官网售价高达8010元，实在让人不易亲近。百代生物荟萃了一群海归博士，大家顶着博士的学衔，总想着要干点什么。于是，锚定Lipofectamine3000的性能，经过几年努力，交出了一份还算满意的答卷，研发出了RFect系列质粒转染试剂。考虑到科研同仁的不同需求，我们的转染试剂中有专门高效转染质粒的试剂，也有既能高效转染质粒DNA也能高效转染siRNA的试剂；既有高效转染贴壁细胞的质粒转染试剂，也有高效转染原代细胞和悬浮细胞的转染试剂，现向诸君具体介绍如下：
一、质粒DNA转染试剂: ? RFect 系列 质粒DNA转染试剂
RFect系列质粒DNA转染试剂专门用于质粒DNA的转染，具有非常卓越的转染性能，可高效转染绝大多数贴壁细胞、原代细胞和悬浮细胞。其中，RFect质粒DNA转染试剂主要用于贴壁细胞的质粒转染，转染效率在贴壁细胞中可高达90%以上，完全媲美Lipofectamine3000的质粒转染效率。RFect悬浮细胞质粒DNA转染试剂主要应用于悬浮细胞的质粒DNA转染，在293F中，转染阳性率可高达85%以上，在CHO-S中，转染效率可达50%以上，显著优于绝大多数同类试剂。特别地，RFect悬浮细胞质粒DNA转染试剂的细胞毒性很低，转染后24小时细胞死亡率不到10%。因而，随着培养表达时间的延长，目标蛋白的表达量将会显著增长，远远优于那些毒性较大的转染试剂。对于原代细胞，考虑到其细胞膜比较敏感，内吞作用不够明显等因素，我们采用了更加温和、低毒的组方----RFect原代细胞质粒DNA转染试剂。在原代肝癌细胞中，其质粒DNA转染效率可达80%以上，而细胞未见明显死亡。RFect系列质粒转染试剂的使用都非常方便，不需要使用特殊的低血清培养基，不需要额外增加培养基成本，也不需要苦苦等待培养4-6小时后换液，只需使用普通的血清培养基就可以了。
表1 ?RFect系列质粒转染试剂
二、质粒DNA和siRNA均可高效转染: ? RFect Prime核酸 转染试剂
RFect Prime系列核酸转染试剂盒是在RFect质粒DNA转染试剂盒的基础上进一步研发成功的可用于各类核酸高效转染的试剂盒。RFect Prime功能强大，不仅可高效转染较大分子的质粒DNA，还可高效转染mRNA、siRNA、mimics、反义核酸和各种小分子DNA，转染效率在贴壁细胞中可高达90%以上。目前，国际上具有如此强大核酸转染功能的转染试剂主要为Lipofectamine3000，这也是其售价如此之高的根本原因。我们经过长期研究，反复实验，研发出的RFect Prime系列核酸转染试剂的性能可完全媲美与Lipofectamine3000。特别地，我们有专门的原代细胞核酸转染试剂和悬浮细胞核酸转染试剂，对原代细胞和悬浮细胞的核酸转染性能显著优于国际同类产品。RFect Prime的转染性能非常专业化，针对部分客户需要将2种以上核酸如质粒DNA和siRNA同时转染入同一细胞，我们研发了RFect?CO?Prime核酸共转染试剂，可完美地将质粒DNA或mRNA与siRNA或反义核酸或小分子DNA转染入同一细胞。在大多数贴壁细胞中，RFect?CO?Prime的质粒转染阳性率可高达90%以上，而在质粒转染阳性的细胞中，95%以上的细胞均可共转染siRNA或反义RNA。RFect Prime系列核酸转染试剂盒的价格具有非常的亲和力，拥有如此强大的转染性能，价格还不到Lipofectamine3000的50%，是绝大多数核酸转染专家的理想选择。
表2 RFect ?Prime系列核酸转染试剂
三、普通质粒DNA转染试剂: ?Lipofect5000 质粒DNA转染试剂
Lipofect5000是一款通用型入门质粒转染试剂，适用于对质粒转染要求不高的研究者，或者研究经费比较紧张的研究者。Lipofect5000可转染绝大多数贴壁细胞和部分悬浮细胞。在贴壁细胞中，Lipofect5000质粒DNA的转染阳性率在60%-70%之间，对于血管内皮细胞，Lipofect5000具有更加优异的转染性能，转染阳性率可高达85%以上。对于普通的质粒转染实验，这样的转染效率已经足够。特别需要指出的是，Lipofect5000的价格非常便宜，0.5mL的定价只有490元，在同类性能的转染试剂中，Lipofect5000的价格属最为优惠的之一。如果您刚刚开始质粒转染实验，或对质粒转染要求不是很高，或者经费比较紧张，Lipofect5000显然是您比较理想的选择。
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